使用說明：

1. 裝載ROS 探針

1.1 原位裝載探針(僅適?于貼壁細胞)

a) 細胞準備：檢測前?天進?細胞鋪板，確保檢測時細胞數量?于5×105 /ml。

b) 藥 物誘導：去除細胞培養液，加???清培養基稀釋的藥 物處理，于37℃細胞培養箱內避光孵育，實際誘導時間由藥 物特性和細胞類型決定。

c) （可選）陽性對照：先???清培養基等稀釋陽性對照（Rosup, 100 mM）到常??作濃度100 μM，加?細胞，37℃避光孵育0.5～4 h，以提?活性氧?平，不同細胞類型存在差異。例如：HeLa 細胞需孵育30-60 min，MRC5 ?胚胎成纖維細胞則需孵育90 min。

d) ROS 探針準備：探針裝載前按照1:1000 ???清培養液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。

e) ROS 探針裝載：吸除處理藥 物，加?適當體積稀釋好的DCFH-DA ?作液。加?的體積需充分蓋住細胞。例如：6孔板通常不少于1000 μL，對于96 孔板通常不少于100 μL。37℃細胞培養箱內避光孵育30 min。

f) 細胞清洗：???清培養液洗滌細胞1～2 次，以充分去除未進?細胞內的DCFH-DA。

1.2 收集細胞后裝載探針(適?于貼壁細胞和懸浮細胞)

a) 細胞準備：按照標準?法培養細胞，必須保證檢測?細胞狀態。按照適當?法，清洗并收集?量的細胞。

b) 藥 物誘導：將收集好的細胞懸浮于適量稀釋好的藥 物，于37℃細胞培養箱內避光孵育，實際誘導時間由藥 物特性和細胞類型決定。

c) （可選）陽性對照：先???清培養基稀釋陽性對照（Rosup, 100 mM）到常??作濃度100 μM，加?細胞，37℃避光孵育0.5～4 h 以提?活性氧?平，不同細胞類型存在差異。例如：HeLa 細胞需孵育30-60 min，MRC5 ?胚胎成纖維細胞則需孵育90min。

d) ROS 探針準備：探針裝載前，按照1:1000 ???清培養液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μM。

e) 探針裝載：除去細胞內藥 物，離?收集細胞，加?稀釋好的探針，使其細胞密度為1×106 ～ 2×107 。

注意：細胞密度需根據后續的檢測體系，檢測?法，以及檢測總量來進?調整。例如：對于流式分析，單管檢測內細胞數?不少于104 ，也不可多于106 。

f) 細胞清洗：???清細胞培養液洗滌細胞1-2 次，以充分去除未進?細胞內的DCFH-DA。

2. 熒光顯微照相操作方法

a) 對貼壁??細胞或活組織，可直接在熒光顯微鏡下觀察；對懸浮??細胞，取25-50 μL 細胞懸液滴到?張顯微載玻?上，再蓋上?張蓋玻?。

b) 熒光顯微鏡下，選?FITC 濾光?觀察熒光，去除背景觀察熒光的變化。

3. 流式細胞分析操作方法

a) 對貼壁??細胞，?胰酶消化制備成單細胞懸液；對懸浮??細胞，直接收集細胞。?0.5-1 mL PBS 重懸細胞(0.5～1x 105 /ml)。

b) 選擇流式細胞儀FL1 或BL1 通道，488nm 激發，測定530nm 的發射，細胞應可分成兩個亞群：ROS 陰性細胞僅有很低的熒光強度，ROS 陽性細胞有較強的綠?熒光。

4.參數設置

使?488nm激發波?，525nm發射波?，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。DCF的熒光光譜和FITC?常相似，可以?FITC的參數設置檢測DCF。DCF的激發光譜和發射光譜參考下圖。